中国中医研究院长城医院  (102200)  朱汉章〖JZ)〗

中国中医研究院基础所  (100041)  张平

中国协和医科大学基础所  (100081)  邢东明

北京红十字会健翔医院  (100029)  郭浩去

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    摘要“力平衡失调是骨质增生的成因”是针刀医学重要的理论构想之一。本实验利用应力装置形成持续压应力作用于体外培养的软骨细胞。结果显示压应力是体外培养的软骨细胞形成细胞因子的重要诱导因素，提示持续压应力与骨质增生可能存在的相互关系。

关键词  针刀医学，软骨细胞，细胞因子，压应力

增生的根本病因”(1)。在这一理论构想的指导下，国内开展了大量利用小针刀治疗骨质增生病因学理论是针刀医学体系的重要组成部分。其核心便是“力平衡失调是骨质骨质增生的临床工作，取得了令人瞩目的临床疗效(2，3)。

    然而，正如任何理论体系的建立完善一样，这一理论构想也必须拥有客观、详实的量化实验方法及实验依据才能得以完善，并更加有力地指导临床实践。

    细胞因子在骨性关节炎病理改变过程中所起的作用已得到高度重视。迄今，大量研究显示细胞因子是骨性关节炎软骨组织炎性破坏降解的重要介质，它们不仅协同抑制软骨组织成份的合成，而且参与软骨组织的破坏分解(4，5，6)，同时与骨质增生的形成有密切的关系(7)。

    为此，我们首先从持续压应力对软骨细胞形成内源性细胞因子影响的关键环节入手，力图探讨应力与骨质增生成因的内在关系，并由此探索建立符合针刀医学自身特点的科学实验框架及方法，以求推动针刀医学理论研究的深入开展。

材料、方法

一、材料、设备及装置

    (一)主要材料、设备：

    1．主要材料：培养基DMEM、胎牛血清、 II型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶(Gibco)。  无菌封口膜(北京植物新技术试验厂)。10ml培养瓶， IL-1、 IL-6、 TNF-@双抗 ELISA试剂盒(Sigma)。

    2．设备：细胞培养箱(Hereus)、离心机、倒置显微镜及照相系统(Olympus)。

    (二)压力装置：主要由定时电源、信号发生器、磁力转换器、箔式应变片、电子万能试验机、 X-Y应变仪、直流电源、力的传动杠杆组成。

二、方法：

    软骨细胞的分离培养

    5个月引产胎儿软骨(北京医科大学妇儿医院提供)，在无菌条件下用 PBS冲洗软骨块剪成1mm2的小块；经0．125％的胰蛋白酶37℃消化30分钟；用1XDMEM 洗两次，在100mm平皿中加入10ml lXDMEM(含 lmg／ml的II型胶原酶和0．1mg／ml的透明质酸酶)37℃消化12-24小时；软骨块软散于平皿底时终止消化，并过细胞筛使其成单细胞悬液，离心后用 PBS洗两次，加入10ml胶原清洗液，4℃放置 15分钟以溶解基质残渣：后用 PBS洗一次。用软骨细胞完全培养液(含 lO％胎牛血清、维生素 C 50ng／ml，古氨酰胺29.2mg／ml)将细胞调整致107个／ml， 37℃、5%孵箱培养，3天换一次液。进行观察并记录照相。

    (二)软骨细胞加压

    将原代培养软骨细胞以105/m1接种于10ml培养瓶中，用无菌培养容器封口膜封口(细菌无法通过，空气可以通过)。将培养瓶置于压力容器内，通入5％ C02进行加压。压力值选O．8个大气压，加压时间分别为 lh、2h、4h。加压方式选择持续加压、间歇加压(频率为1次／2分钟)。各组加压结束后，将培养瓶中成分离心，取上清液。

    (三)酶联免疫检测

     将上清液放出后，分别用 IL-l、 IL-6、 TNF-a双抗体 ElISA试剂盒进行常规检测，

进行结果分析。

结果

    一、实验组、对照组各时间段IL-1、 IL-6、 TNF(0T值， S±X， N=6)

    二、对照组各时间段IL-l、 IL-61 TNF值无差异。

讨  论

     一、正常骨关节关节面间相互作用是在一种动态的力学环境中完成的。在骨折外固定关节制动、关节周围软组织损伤挛缩等疾病条件下，关节腔内的应力环境发生变化，关节面间持续性应力接触时间加长，应力幅度加大，临床上很容易导致相应骨关节骨质增生的发生(1，6)。因此，本实验首先选择持续压应力作为实验应力条件。

二、骨性关节炎的核心首先是软骨组织的病变。软骨组织是结缔组织的一种，其特征为含有丰富的细胞间质，从而保持组织的完整性以完成其相应的功能。胶原蛋白、蛋白多糖是软骨组织的重要基质成分，其合成与分解在正常软骨组织中处于平衡状态．这种平衡实质上是基质成分的合成与降解动态的平衡状态。诸多基质蛋白酶参与胶原蛋白及蛋白多糖的降解(8，9)。而细胞因子(IL-1、 IL-6、TNF)能够特异性地作用软骨细胞及滑膜细胞参与调节这些基质蛋白酶的形成，同时抑制胶原蛋白、蛋白多糖的合成(4，5，10)。因而，细胞因子不仅对软骨组织的破坏具有意义，同时抑制软骨组织的修复。另外，细胞因子IL-1通过刺激人成骨样细胞的增生参与骨性关节炎中骨质增生的形成(7)。然而，细胞因子的来源及作用方式目前尚未能明确。本实验显示，持续压应力是诱导体外培养的软骨细胞产生细胞因子的重要因素。这不仅为应力在骨性关节炎发病中的意义提供了依据，而且提示应力是骨性关节炎软骨组织中细胞因子来源的重要诱导因素。同时，也从细胞因子的因素提供了一个理解应力与骨质增生相互关系的角度。

三、本实验中 TNF、 IL-6、 IL-1在不同的作用时间中，均出现了持续压应力促进细胞因子的产生超过间歇压应力组，这提示持续性压应力能够明显增强体外培养的软骨细胞产生细胞因子。

    四、对照组三个时间段各细胞因子间不存在差异，这提示体外培养的软骨细胞自身产生细胞因子量在本实验中不存在随时间变化的情况。

    五、应该明确的是，力的大小、作用方向、作用点及作用时间在探讨应力与生物组织的相互作用时必须予以量化。“力平衡”的概念是指在生物体特定的环境中应力的上述指标处于正常生理范围内。本实验所选择的压应力的量及间歇压频率不能简单地等同于体内的情况。然而，体外实验的结果毕竟从特定的角度反映了生理现象的本质；另外，这一实验无疑也将运动系统复杂的力学环境得以量化，为今后进一步探讨针刀医学其他理论构想确定了一个有意义的研究方向。

参考文献(略)

  1．朱汉章，小针刀疗法，中国中医药出版社，1992

  2．第三届全国针刀医学学术大会论文集，中国中医药学会针刀医学会，1994

  3．第四届全国针刀医学学术大会论文集，中国中医药学会针刀医学会，1997

  4.Masayuki S, et al. The role of cytokines in chondrocyte mediated cartilage d

egradation. J Rheumatol 1989;(suppl18)16:32-4. 

  5.Jean-Pierre Pelletier, et al. Are cytokines involved in .osteoarthritic path

opliysiology? Seminars in Arthritis and Rheumatism Vol 20, No.6, Suppl 2(June),

1991 :pp 12-25.  6.Sack KE. Osteoarthritis--a continuing challenge. West J Med 1

995; 163:579-586.

  7.Bunning RA, Richardson HJ, Crawford A, et al: The effect of interleukin-l on

 connective tissue metabolism and its relevance to arthritis. Agents Actions 18:

 131-152,1986(supple)

  8. Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Howell DS, et al: Collagenase and collage

nolytic activity in human osteoarthritic cartilage. Arthritis Rheum 26:63-68, l9

83 .

  9.Murphy G, Cochett MI, Stephens PE, et al: Stromelysin is an activator of pro

collagenase. A study with natural and recombinant enzymes. Biochem J 248:265-268

, 1987

  l0.Arner EC, Pratta MA: Independent effects of interleukin-l on proteoglycan b

reakdown, proteoglycan. synthesis,and prostaglandin E2 release from cartilage in

 organ culture. Arthritis Rheum 32:228-297, 1989.〖FL)〗