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王健瑞1 乔晋琳2路平2邓轶1刘凤桐1车向宜1 董兆德 2陈蕾1马广昊2
［摘要］目的 通过模拟第三腰椎横突周围无菌性炎症的方法，建立第三腰椎横突综合征动物实验模型，于两种不同动物重复用同一造模方法以考察其可靠性。材料和方法 将90只SD大鼠随机分为四组；正常组、假手术组、材料实验组及模型组。于造模后4天、10天、30天进行组织病理学观察；4天、10天、30天进行全血、前列腺环素、内皮素、5-羟色胺观察；0、1、8、15天进行机械性压迫痛阈实验；将20只日本大耳白纯种兔随机分为四组；模型组、材料实验组、假手术组及正常组。于造模后4天、10天、30天进行组织病理学观察；4天、10天、30天进行全血、前列腺环素、内皮素、5-羟色胺观察；0、1、8、15天进行机械性压迫痛阈实验。结果 本模型可以在第三腰椎横突周围出现明显无菌性炎症、瘀血、水肿及后期有瘢痕形成。经组织细菌培养，无细菌感染。模型组炎性介质等指标显著高于材料实验组、假手术组及正常组（p<0.01）。结论 本模型可以对第三腰椎横突周围无菌性炎症作出真实反映。
［关键词］第三腰椎横突综合征 无菌性炎症 骨骼—肌肉系统功能性损伤 反复性应力损伤 动物模型
Establishment and experimental study of the third lumber vertebrae transverse foramen syndrome of animal test model in rats、rabbits Wangjianrui,Liufengtong,etc.( Beijing Uinversity of TraditionalChinaese Medicine,Beijing100029)QiaojinglinLuping.etc.(NAVY hospital Beijing 100037)
[Abstract] Objective Establish model of the third lumber vertebrae transverse foramen syndrome in the rat、rabbit though imitive aseptic inflammation around the third lumber vertebrae transverse foramen.Methods 90 SD rats 、20 rabbits were divied into 4 groups : model groups、false operation groups、method test groups、normal groups.Patological observation on the 4、10、30days after operation ,ET-1and 5-HT、6-keto-PGI21аRIA obervation on the 4、10、30days after operation . Changes in mechanical stimulation withdraw threshold obervation on the 1、8、15、days after operation. Results this model could obviously lead to in flammation、extrvasated blood 、dropsy and function damnification of the nerve conduet. As compared with the N group,significant differencein the M group of ET-1, PGI2,5-HT(p<0.05).Conclusions the method of the imitive aseptic inflammation could reflect functional bone—muscular stress clearly aseptic inflammation model of the third lumber vertebrae transverse foramen syndrome.
[Key words]： Third lumber vertebrae transverse foramen syndrome Functional bone—muscular Aseptic Inflammation Recurrent stress lesion myofascitis Animal test model
第三腰椎横突综合征作为一类骨科常见病有其复杂的病因学、病理生理及生物力学机制。其中，骨骼—肌肉系统解剖学及力学改变对于其发病有重要影响。一般认为:急慢性损伤引起的疼痛（原发因素），好发部位多在骨骼肌与肌腱和韧带附着处。本综合征主要由于第2腰神经后外侧支穿过横突背侧，向下进入骶棘肌时，附丽于横突上的肌纤维、韧带及其他组织周围因为骨骼—肌肉系统无菌性炎症损伤产生粘连及瘢痕，这种损伤和炎症刺激不但可造成神经系统的功能障碍，如感觉、运动和植物神经功能的丧失，而且常常可导致神经行为的减退和丧失，亦可导致神经行为的异常表现，如痛觉过敏，表现为机体对各类伤害性刺激的敏感性和反应性显著增强；痛觉感觉异常，一种对非伤害刺激作出伤害感觉性反应。目前临床对于上述炎性疾病多采取针灸、理疗等非药物性治疗方法。如何对以上方法进行评价；需要多方面的研究工作。我们通过建立一种与临床相适应的动物模型，从实验研究角度来探讨第三腰椎横突综合征发病原因、病理生理及相关治疗方法的疗效评价。两年以来，我们用化学性损伤，药物性损伤或改变其力学结构的方法，以鼠、兔两种动物作为实验对象，对于单一致炎因素在同一时期对于第三腰椎横突周围组织的炎性作用进行反复观察,现将以明胶海绵为材料的实验情况报告如下。
材料和方法
1材料
1.1动物
雄性SD大鼠90只，二级，三月龄，体重300-350g,由北京维通利华实验动物中心提供，在中国中医研究院基础所实验动物中心二级动物室喂养。雄性大耳白纯种兔20只，一级，体重2-2.5Kg，由北京富华实验动物养殖场提供，喂养条件同鼠。
1.2药物与试剂
明胶，苏卫药准字295901号；南京第三制药厂；6-酮-前列腺素F1аRIA试剂盒，卫药准字R-69号；内皮素-1试剂盒，卫药准字R-68号；均由中国人民解放军总医院科技开发中心提供，中国人民解放军海军总医院海科锐放免中心测定。全血指标由海军总医院检验科测定。5-羟色胺由中日友好医院临床研究所生理室测定。
2方法
2.1 动物分组
两种动物喂养3～5天后都随机分为四组:Ⅰ组,正常对照组; Ⅱ组, 模型组 ; Ⅲ组, 材料实验组,其意义检验材料的生物相容性，排除干扰因素; Ⅳ组假手术组。
2.2主要药物及试剂
模型制作：手术过程;10%速眠新（25mg/kg）大鼠、兔肌肉麻醉。麻醉满意后，无菌术下取大鼠、兔腰背部纵向切口3cm,向两侧剥离骶棘肌，显露L3～L4棘突，用微型骨科器械处理其横突周围组织至椎板，小心保护腰神经出椎间孔处组织结构,完整分离腰脊深筋膜脊神经后支穿出部分。然后，抽签选择三种不同处理。模型组：切除部分明胶海绵约0.5㎜×0.5㎜大小,植入腰三横突后半段深筋膜中层下，保留完整肌筋膜,彻底止血。假手术组：分离至腰脊筋膜下，显露腰三横突。材料实验组：如模型组同样处理，同样大小明胶海绵置于臀大肌下。正常组为不做任何处理。所有动物骶棘肌筋膜及皮肤均用0号线各等距离缝合三针，切口用庆大霉素反复冲洗，用免贴妥喷雾。麻醉苏醒后在同一饲养条件下饲养，于4天、10天、30天各组随机选取动物进行各项观察与指标检测。
2.3取血
大鼠第4天、10天、采用摘除眼球法取血，第30天用颈动脉插管取血法。兔第4天、10天、及30天均采用耳缘背侧静脉穿刺。
2.4取材
大鼠断颈法处死后，兔气栓法处死后，立即取L3～L4腰椎节段福尔马林固定；并取新鲜组织作牛血清细菌培养。
2.4检测指标
2.4.1 PGI2静脉穿刺血浆3ml、ET-1静脉穿刺血浆5ml即刻与消炎痛-EDTA.Na2液0.2ml在一次性5ml空针内混匀，注入试管内，4℃离心3500rpm,15min，分离血清, -20℃保存。
2.4.2 5-HT静脉穿刺血清3ml即刻与低分子肝素在一次性5ml空针内颠倒混匀，注入玻璃试管内，4℃离心3500rpm,15min，分离血浆,-20℃保存。
2.4.3 PLT 静脉穿刺血浆1ml即刻与低分子肝素2ml在一次性5ml干燥管内颠倒混匀，4℃保存。
2.4.4机械性痛敏实验 自制的痛觉测定器测定痛觉阈值。测定器由一个10 ml的塑料注射器改制而成，将注射器的针尖磨钝，内芯做成活塞。测定时将注射器针头置于左侧后肢的第4，5跖骨之间，然后再将砝码加于注射器的活塞上，每次加6 g，直到大鼠产生收缩反应，记录收缩时的砝码质量。每次测试至少间隔10 min，测量3次，取其平均值。以术前1 d测得的痛阈值为基础痛阈。并由以下公式：〔（造模后的后肢收缩砝码质量-基础痛阈）/基础痛阈）×100%，计算出其变化百分数，以此为测定痛阈变化的指标。结果为正值表示痛觉反应迟钝，负值表示痛觉反应过敏。
2.4.5光镜观察取所有动物的关节节段，4%福尔马林固定、5%硝酸脱钙，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，HE染色。光镜下观察肌肉、韧带及其炎性病理改变。
2.5 统计学处理 各组数据均以平均值±标准差（ ±s）表示，组间比较用均数差别的t检验。P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有非常显著性。
3 结果：
3.1 两种动物不同时期血浆PGI2（pg/ml）、ET（pg/ml）等含量的变化
模型组术后4～30天PGI2有明显的升高，然后逐渐恢复正常。材料组术后亦产生明显的升高，与模型组相比有显著差别（P<0.05）；而在假手术组，大鼠的PGI2升高程度较模型组大鼠明显降低，但与材料实验组无显著性差别。ET各组间、不同时期无显著性差别。
表1大鼠不同观察时期血浆PGI2、ET等含量的变化
n 4d 10d 30d
PGI2
ET-1
PGI2
ET-1
PGI2
ET-1 ET
模型
30
340.5±26*
149.3±21
125.8±13.8*
148.4±33
211.2±56*
143.±6.4
材料实验组
30
864.9±9**Δ
148.8±85
880.3±37**Δ
159.4±52
550.9±73**Δ
145.6±72
假手术组
20
759.1±84
153.5±69
1409.3±150
144.993±87
664.5±32
136.1±99
正常组
10
1440±160
107.9±85
1005.4±131
128.2±28
1121.9±22
134.8±12
注：与正常组比*P<0.01,**P<0.05;与模型比ΔP<0.05
表2兔不同观察时期血浆PGI2（pg/ml）、ET（pg/ml）等含量的变化
n 4d 10d 30d
PGI2
ET-1
PGI2
ET-1
PGI2
ET-1
模型
5
255.2±34*
196±23
578.8±38*
160±12
1822±54
157±32
材料实验组
5
1045±32**Δ
184±12
1281±23Δ
154±1.8
190±6**Δ
154±2
假手术组
5
771±56
211±2
563.2±34
150±21
1233±33
221±23
正常组
5
1359±42
127.1±11
1134.79±12
116±34
1098±12
117±13
3.2 两种动物不同时期血浆PLT、5-HT含量的变化
模型组术后4～30天5-HT含量有明显的升高，然后逐渐恢复正常。材料组术后5-HT含量亦升高，与模型组相比有显著差别（P<0.05）；而在假手术组5-HT含量升高程度较模型组低，与材料实验组无显著性差别。PLT含量无显著性差别。
表3大鼠不同观察时期血浆PLT(10^g/l)、5-HT(ng/ml)等含量的变化
n 4d 10d 30d
PLT
5-HT
PLT
5-HT
PLT
5-HT
模型
30
643±54*
242±11*
755±34*
159±8*
980±23*
239±21*
材料实验组
30
765±43**
186±4**△
631±67**
134±14**△
780±33**
174.2±46**△
假手术组
20
665±54
124±4
567±45
66．3±3
665±56
112±12
正常组
10
450±12
54±12
493±71
64±6
460±12
55．7±4
表4兔不同观察时期血浆PLT(10^g/l)、5-HT(ng/ml)等含量的变化
n 4d 10d 30d
PLT
5-HT
PLT
5-HT
PLT
5-HT
模型
5
432±23*
411±12*
320±32*
914±52*
220±21*
560±23*
材料实验组
5
342±22**
223±22**Δ
287±33**
190±23**Δ
87±6**
234±26**Δ
假手术组
5
234±11
232±22
90±45
125±34
120±14
111±23
正常组
5
130±12
112±12
134±5
143±34
143±3
142±23
3.3大鼠机械刺激回缩阈值的变化
在观察期间,所有各组大鼠在休息及行走时均未表现出任何运动功能障碍，在站立及休息时也未表现出喜欢用某一侧肢体来承重的现象。模型组术后3～15d产生较明显的机械刺激过敏行为，然后逐渐恢复正常,在术后0、1,8,15d统计学分析差别显著（P<0.05）,假手术组与正常组痛阈无改变。
n 0d 1d 8d 15d
模型
30
63%
88%*
57.5%*
70%
材料实验组
30
70%
18%
71%
23%
假手术组
20
45%
46.67%
10.3%
8%
正常组
10
45%
40%
46%
40%
3．4组织形态学观察
从本实验病理切片看，模拟椎旁骨骼—肌肉系统无菌性炎症的的实验方法造成了大白鼠、兔横突周围明显的无菌性炎症。术后不同时期的观察表明；病理变化由充血、水肿及炎症细胞渗出，肉芽肿形成，逐步向胶原化、瘢痕化过渡。各组病理变化如下：（1）4天；模型组动物切片血管扩张、瘀血，神经纤维水肿。肌肉炎症反应较重，炎性细胞及红细胞较密集，结缔组织、筋膜内反应较轻，材料周围未见异物细胞反应，显示其有良好的组织相容性，视野中无细菌(附图1、2)。假手术组上述反应较轻，正常组与材料组无异常。（2）10天；模型组动物切片依然有组织充血，肌肉、结缔组织内炎症反应程度相当，炎性细胞较密集，材料已崩解，大多被细胞吸收(附图3、4)。假手术组上述反应较轻，正常组与材料组无异常。（3）30天；材料已完全被吸收，肌肉内炎症反应较轻，损伤已修复。肌腱筋膜内细胞集聚，成纤维细胞开始增生，胶原重建开始，可见原始瘢痕形成(附图5、6)。
4 讨论
对腰椎旁肌原性损伤的临床和基础研究已经有很长时间的历史，但对肌腱和韧带等软组织损伤研究却极为有限。大量有关肌腱和韧带损伤、修复和移植的基础研究只证实了肌腱和韧带在修复环境下组织特性会发生改变，但尚无使用无菌性关节炎的动物模型作肌腱和韧带炎性病理过程研究的报告〔1〕。通常使用的炎症造模方法多为免疫介导的炎症反应，无研究证实此反应过程和创伤后炎症反应一致〔2〕。而创伤后炎症反应具有怎样的修复过程，组织特性发生怎样的改变，是否会对外周神经造成损伤，我们通过建立此类疾病中较常见的第三腰椎横突综合征动物模型，来对上述机制有所认识。腰三横突在腰椎中有特殊地位和作用,其末端所承受的拉应力较其它腰椎横突大。当腰部受力过大或长期不良工作体位时, 因第三腰椎横突最长，故作为杠杆所受作用力最大。附着其上的所有韧带、肌肉、筋膜，肌腱承受到的拉力也最大，较易于损伤，从而引起腰三横突末端组织的急慢性损伤,腰三横突末端血管受累有碍于局部组织的供养,可引起或加重腰三横突末端组织的病理变化。
回顾关于第三腰椎周围软组织的解剖关系的文献报告。王氏〔6〕等对横突长度及其旋后角进行了系统研究，认为横突旋后角是腰部损伤的基础和原因。陈氏〔5〕对腰神经后支的解剖研究表明；腰神经后支及其分支与椎间关节和腰部软组织的关系对引起腰腿痛有极其重要的作用。腰神经后支是在椎间孔处发自腰神经主干，向后外行于上关节突的外側，至横突间韧带内缘的后支骨纤维孔处分为腰神经后内支和后外支。全部后支均有血管伴行，共同穿越横突间骨纤维孔，其中伴行静脉较动脉粗；在此处后支主干多位于血管的外側并紧邻横突间韧带。对腰神经后支的解剖研究表明；腰神经后支发出后经横突间韧带内缘之骨纤维孔，并分支成后内側支，后外側支及窦椎神经等。其中各后内支重叠分布于椎间关节联线以内的关节囊、韧带和结缔组织；后外支在深部分支配竖脊肌后穿出。该肌组成臀上皮神经，该组皮神经组成不同于教科书上的描述。窦椎神经返回椎管支配相邻上、下椎间盘及相邻结构。相邻的各后支及其分支存在分支存在丰富吻合。上述腰神经后内支和后外支在分布行程中均须穿过不同的部位的多个骨纤维管、孔，这些骨纤维管、孔受病损影响易变形，缩窄而卡压神经致慢性腰腿痛。而后内支的重叠分布和各后内支的重叠分布和各后支及分支间的丰富吻合微正是后支卡压症反射痛的形态基础，以至腰腿痛复杂化。由此导致的疼痛引起肌痉挛（早期）和肌挛缩，引起肌附着处软组织的疼痛，累及相关肌群，过度紧张出现反射性的肌痉挛〔3〕。
宁夏医学院解剖教研组〔7〕着重在解剖腰神经后支及其内、外侧分支的行径、分布范围和吻合情况进行了研究,他们认为诸多吻合支形成了腰丛,由此产生的腰痛为多支脊神经受害的结果。蚌埠医学院解剖教研组〔8〕通过174例标本的观察，测量了腰神经后支、后内侧支、及后外侧支的直径、长度、行径及其通过的骨纤维孔、骨纤维管以及髂嵴上缘与腰背筋膜之间的形成、内径及位置。通过对臀上皮神经来源及组成的观察，发现其有五种不同分型。该文着重研究了上述解剖结构对于临床的意义。上述文献都力图在第三腰椎横突综合征神经受害支找到证据，目的以神经源性的疼痛来对第三腰椎横突综合征作出解释。但我们看到；腰神经后外侧支与其他腰椎的后外侧支有丰富的吻合支，单一神经的受压或损伤并非是腰部不适的所有原因。因此，我们据此设计对于腰脊神经后外侧支横突点周围造成局阈性无菌性炎症的方法是有其解剖形态学基础的。陈氏〔9〕解剖研究了腰脊段神经后支及其分支，并测定了后外侧支在三维运动时的所受拉力该实验还证明；腰神经后支在腰椎前屈，对侧弯曲，对侧旋转时易受牵拉，腰椎不稳定节段最容易产生后支性腰痛。作者认为后支经过横突后走行在丰富的脂肪组织床中，受损伤的机会较小。所以我们进一步确定本病的动物模型致炎范围应在腰三横突后半段深筋膜中层下。
生物化学物质和神经肽类在炎性疼痛调制过程中起重要作用，它们或可直接刺激神经末梢激发疼痛，或可降低痛阈，损伤或炎症组织所释放的内源性物质在伤害刺激和疼痛感受器放电之间有因果关系。多种由非神经组织释放的内源性化学物质具有致痛作用，包括缓激肽、5—羟色胺、白三烯等。这些物质可兴奋分布在皮肤、骨、关节和肌肉中对热和机械刺激敏感的C-或A-型伤害传入纤维。一般认为，低浓度的5—HT在炎症中即可产生疼痛。我们的研究结果显示；模型组的5—羟色胺4、10天在相对较高水平，30天时降低，术后亦产生明显的机械刺激过敏行为，与材料组模型组相比有显著差别（p<0.05）。大鼠的机械刺激过敏程度材料实验组与假手术组无显著差别。急性损伤时，由于软组织受损，其出血及坏死组织的分解，使附着处的神经末梢受到创伤性无菌性炎症的化学刺激而引起疼痛。炎症后期，慢性损害的发生也是基于同样的病理过程，无菌性炎症使软组织和肌肉粘连受到大量的牵拉刺激，最终激发种种效应器官出现痛阈由敏感到降低直至重又升高的趋势。
一般认为，在考虑创伤修复过程中的不同组织反应程度时，炎症介质与其他递质相关性是非常重要的。6-酮-前列腺素F1а是PGI2较稳定的非酶裂解产物，血小板是无菌性炎症的一个特异性指标，可反应出血栓素A2,环—磷酸腺苷（CAMP）水平。血栓素A2、PGI2在体内的变化主要是一些酶类的变化有关。血小板过多会引起PGI2减少而发生瘀血有关的疾病。相反，血小板环—磷酸腺苷（CAMP）水平增高，抑制分解环—磷酸腺苷（CAMP）的磷酸二脂酶，可促进PGI2生成。本实验表明：模型组、材料实验组假手术组三个不同时期经放免测定，有显著性差异p<0.05，说明该造模方法凝血机制改变较明显。假手术组与正常组比较无显著性差异，p＞0.05。
内皮素是一种首先由猪的血管的内皮细胞中分离的纯化出的21个氨基酸组成的生物活性肽，其具有强烈的收缩冠状动脉，肾小动脉、刺激心钠素的释放，提高全身血压、抑制肾素释放等作用，它是迄今已知最强的收缩血管物质〔10〕。现有研究证明，内皮素产生的控制紊乱在高血压和血管痉挛发生机制中具有重要作用。我们的研究结果显示；机体受到创伤后，局部内皮素急剧升高，术后24小时升达最高，此后逐渐降低。创伤介导的无菌性炎症是一种局部的持续刺激，一方面可能导致受损的血管内皮细胞渗漏增加，另一方面也可能是由于血管内皮细胞在创伤刺激下对ET的合成分泌增加。血管壁组织ET含量的升高是导致局部血管痉挛发生发展的重要因素，在手术刺激下，血管内皮细胞合成的ET以旁分泌方式作用于邻近的血管平滑肌细胞上的ET受体，引起ET一系列生物学效应，尤其是血管收缩效应。术后4天，ET水平逐渐下降接近术前水平，是由于术后时间的延长，机体对炎症刺激渐趋适应，使ET合成分泌降低，也可能由于ET合成分泌随血液循环至实质性脏器(肺、肝、肾)后，被这些器官上高亲合力的受体结合而清除，或ET由于酸解，自身降解而清除。局部ET的适时清除有利于局部血管强烈痉挛的恢复，ET放免结果显示；初期内皮素各组显著增高，随着时间变化，逐渐降低，组间变化不明显。血浆ET-1水平变化可能是系统性红斑狼疮病活动期发生、发展的重要因素,我们认为血浆ET-1中、后期为正常水平说明本模型成功反应出了局限性炎症的特点〔11〕，与免疫介导的全身性炎症有根本性区别。
参考文献
1 Gleeman R,Goldberg V,An K-N,Banes A:Tendon,in Woo SL-Y,Buckwalter JA (eds): Injury and Repair of Musculoskeletal Soft Tissues.Park Ridge,IL,American Academy of Orthopaedic Surgeons,1988,pp5-40.
2 Schumacher HR Jr:Morphology and physiology of normal synovium and the effects of mechanical stimulation,in Gordon SL,Blair SJ,Fine LJ (eds):RepetitiveMotion Disorders of the Upper Extremity.Rosemont,IL,American Academy of Orthopaedic Surgeons,1995,pp 263-276.
3宣蛰人 软组织外科理论与实践.第一版.北京：人民军医出版社，1994.23
4 Mense S 1981 Sensitization of group Ⅳ muscle receptors to bradykinin by 5-hydroxytrytamine and prostaglandin E2.Brain Reasearch 225:95-105
5陈跃，吴炳煌. 腰神经后支的解剖与腰神经后支卡压综合征.中国骨伤,2000,6:23-25
6 王玉海，郭连魁.腰椎横突长度及其旋后角的应用解剖.中国临床解剖学杂志，1992，10：109-111.
7宁夏医学院解剖教研组.腰神经后支的解剖观察.中华外科杂志,1977,2:103-105
8苗华,严麟书,黄恭康.腰神经后支的解剖及其临床意义.解剖学报,1984,15:19-27
9陈志伸，邵振海，朱青安.脊神经后支性腰痛的解剖学和生物力学研究.骨与关节损伤杂志.1994,9:116-118
10 Biochem Biophys Res Commun 1989:161(1):562
11陶怡.系统性红斑狼疮活动期血浆降钙素基因相关肽及内皮素-1含量变化.中华风湿病学杂志 .1998,2: 161-163
12 周舒,娄艾琳. 5—羟色胺的生理和病理生理. 第一版.北京：人民卫生出版社，1988.48
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